Distigmin wirkt, indem es das Enzym Acetylcholinesterase hemmt. Dieses Enzym ist für die Spaltung von Acetylcholin zu Acetat und Cholin verantwortlich. Distigmin unterbindet diese Spaltung. Dadurch erhöht sich die Konzentration von Acetylcholin im synaptischen Spalt und die Wahrscheinlichkeit einer Muskelkontraktion nimmt zu. Dies wirkt sich vor allem positiv auf die Schließmuskel der Harnblase und des After aus, wodurch man die therapeutischen Effekte bei Harninkontinenz sowie bei chronischer Verstopfung erklären kann. Bei der Myasthenia gravis wird ebenfalls die Wahrscheinlichkeit einer Muskelkontraktion erhöht.
Die Bioverfügbarkeit, also zu wie viel Prozent der Wirkstoff im Blut verfügbar ist, liegt bei weniger als 5%. Die Halbwertszeit, also die Zeit, die der Körper benötigt, um die Hälfte des Wirkstoffes auszuscheiden, liegt bei ca. 69 Stunden. Distigmin gelangt nicht über die Blut-Hirn-Schranke.