La distigmine agit en inhibant l'enzyme acétylcholinestérase. Cette enzyme est responsable de la décomposition de l'acétylcholine en acétate et en choline. La distigmine empêche cette décomposition. Cela augmente la concentration d'acétylcholine dans la fente synaptique et la probabilité d'une contraction musculaire augmente. Cela a surtout un effet positif sur les sphincters de la vessie et de l'anus, ce qui explique les effets thérapeutiques en cas d'incontinence urinaire ainsi qu'en cas de constipation chronique. Dans la myasthénie grave, la probabilité de contraction musculaire est également augmentée.
La biodisponibilité, c'est-à-dire le pourcentage de la substance active disponible dans le sang, est inférieure à 5%. La demi-vie, c'est-à-dire le temps nécessaire à l'organisme pour éliminer la moitié de la substance active, est d'environ 69 heures. La distigmine ne franchit pas la barrière hémato-encéphalique.