La distigmina agisce inibendo l'enzima acetilcolinesterasi. Questo enzima è responsabile della scissione dell'acetilcolina in acetato e colina. La distigmina impedisce questa scissione. Ciò aumenta la concentrazione di acetilcolina nella fessura sinaptica e la probabilità di contrazione muscolare aumenta. Ciò ha un effetto particolarmente positivo sui muscoli sfinterici della vescica e dell'ano, il che spiega gli effetti terapeutici sull'incontinenza urinaria e sulla stipsi cronica. Anche nella miastenia gravis aumenta la probabilità di contrazione muscolare.
La biodisponibilità, cioè la percentuale di principio attivo disponibile nel sangue, è inferiore al 5%. L'emivita, cioè il tempo necessario all'organismo per espellere metà del principio attivo, è di circa 69 ore. La distigmina non attraversa la barriera emato-encefalica.