Distigmine werkt door het enzym acetylcholinesterase te remmen. Dit enzym is verantwoordelijk voor de afbraak van acetylcholine in acetaat en choline. Distigmine voorkomt deze splitsing. Hierdoor stijgt de concentratie acetylcholine in de synaptische spleet en neemt de kans op spiercontractie toe. Dit heeft een bijzonder positief effect op de sluitspieren van de blaas en de anus, wat de therapeutische effecten op urine-incontinentie en chronische constipatie verklaart. Bij myasthenia gravis wordt de waarschijnlijkheid van spiercontractie ook verhoogd.
De biologische beschikbaarheid, d.w.z. het percentage van het werkzame bestanddeel dat beschikbaar is in het bloed, is minder dan 5%. De halfwaardetijd, d.w.z. de tijd die het lichaam nodig heeft om de helft van de werkzame stof uit te scheiden, is ongeveer 69 uur. Distigmine passeert de bloed-hersenbarrière niet.