La nafazolina agisce legandosi agli adrenorecettori alfa-1 presenti nei vasi sanguigni. Questo legame porta al rilascio di noradrenalina, che si lega agli stessi recettori. Dopo il legame, i vasi sanguigni si restringono (vasocostrizione). Di conseguenza, una minore quantità di sangue raggiunge la regione interessata e la mucosa del naso diventa meno gonfia. Negli occhi, la riduzione del volume sanguigno fa sì che un minor numero di sostanze infiammatorie raggiunga la regione interessata, con conseguente riduzione dell'infiammazione oculare.
Tuttavia, poiché la nafazolina si lega anche agli adrenorecettori beta in forma indebolita, i vasi si dilatano (vasodilatazione) dopo che gli adrenorecettori alfa-1 smettono di funzionare, invertendo così l'effetto. La nafazolina, quindi, allevia solo i sintomi della rinite e della congiuntivite, ma non ne combatte la causa.
Inoltre, il rilascio di noradrenalina provoca un circuito di feedback negativo, cioè la riduzione della produzione di noradrenalina, che può portare a un'infiammazione della mucosa nasale indotta dal farmaco (rinite medicamentosa) se lo spray nasale viene utilizzato per troppo tempo. Questo porta alla dipendenza e la nafazolina deve essere utilizzata ogni poche ore per combattere il gonfiore.
La nafazolina viene scomposta dal fegato, ma la maggior parte viene escreta immutata nelle urine. L'effetto della nafazolina può durare dalle 4 alle 8 ore.