A distigmina actua através da inibição da enzima acetilcolinesterase. Esta enzima é responsável pela decomposição da acetilcolina em acetato e colina. A distigmina impede esta clivagem. Isto aumenta a concentração de acetilcolina na fenda sináptica e a probabilidade de contração muscular aumenta. Isto tem um efeito particularmente positivo nos músculos do esfíncter da bexiga e do ânus, o que explica os efeitos terapêuticos na incontinência urinária e na obstipação crónica. Na miastenia gravis, a probabilidade de contração muscular é igualmente aumentada.
A biodisponibilidade, ou seja, a percentagem do princípio ativo disponível no sangue, é inferior a 5%. A semi-vida, ou seja, o tempo que o organismo necessita para excretar metade da substância ativa, é de aproximadamente 69 horas. A distigmina não atravessa a barreira hemato-encefálica.