La distigmina actúa inhibiendo la enzima acetilcolinesterasa. Esta enzima es responsable de la descomposición de la acetilcolina en acetato y colina. La distigmina impide esta escisión. Esto aumenta la concentración de acetilcolina en la hendidura sináptica y aumenta la probabilidad de contracción muscular. Esto tiene un efecto especialmente positivo sobre los músculos del esfínter de la vejiga y el ano, lo que explica los efectos terapéuticos sobre la incontinencia urinaria y el estreñimiento crónico. En la miastenia gravis, también aumenta la probabilidad de contracción muscular.
La biodisponibilidad, es decir, el porcentaje del principio activo disponible en la sangre, es inferior al 5%. La semivida, es decir, el tiempo que necesita el organismo para excretar la mitad del principio activo, es de unas 69 horas. La distigmina no atraviesa la barrera hematoencefálica.